Detección de Listeria Spp. en queso fresco a través de un método isotérmico basado en las regiones V1-V2 del 16S ARNr

Abstract

La listeriosis es una enfermedad transmitida por alimentos causada por Listeria monocytogenes, cuya presencia representa un riesgo importante para la salud pública en México, especialmente por su elevada incidencia en productos lácteos frescos. Esto resalta la importancia de implementar métodos de detección rápidos, sensibles y confiables para prevenir brotes y garantizar la inocuidad alimentaria. El objetivo de este trabajo fue detectar Listeria spp. en queso fresco mediante amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), utilizando la región V1-V2 del gen 16S ARNr como marcador y comparar el método con técnicas convencionales. Se evaluaron cinco métodos de extracción de ácidos nucleicos y se optimizaron las condiciones de reacción para LAMP considerando variables como concentración bacteriana (1x101 a 1x109 UFC/ml), pureza del ADN, tiempos de incubación y costos. El protocolo establecido cuya detección se basó en el cambio colorimétrico y la cuantificación espectrofotométrica (ΔAbs = 434 – 560 nm), se comparó con PCR convencional y el método microbiológico establecido en la NOM-143-SSA1-1995. Los resultados obtenidos durante la estandarización de la técnica de LAMP demostraron que el método de ebullición fue el más eficiente, compatible y reproducible, permitiendo la detección de L. monocytogenes hasta 1x101 UFC/ml y L. innocua hasta 1x103 UFC/ml; además, alcanzó una sensibilidad de hasta 100 fg de ADN, superando entre 10 y 1000 veces a la PCR convencional, con tiempos de detección menores a 60 minutos. La evaluación del protocolo en un contexto real se probó en 30 muestras comerciales donde se evaluaron valores de pH cercanos a la neutralidad y alteraciones organolépticas asociadas a contaminación por deficiencias en el procesamiento. Las muestras positivas fueron aisladas e identificadas taxonómicamente mediante la secuenciación del gen 16S ARNr y el análisis filogenético, lo que confirmó la identidad de L. monocytogenes con alta similitud (>98%). El protocolo propuesto puede considerarse una herramienta de diagnóstico integral, rápida, sensible y de bajo costo, como alternativa para la detección de Listeria spp. en la industria alimentaria.